本試劑僅供研究使用  標本：血清或血漿

試驗原理：

IL-6試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）.已知IL-6濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將IL-6和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶結合物，然后加入底物A、B，和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中IL-6的濃度呈比例關系。

試劑盒內容及其配制

試劑盒成份（2-8℃保存）96孔配置48孔配置配制

96/48人份酶標板1塊板（96T）半塊板（48T）即用型

塑料膜板蓋1塊半塊即用型

標準品：800pg/ml1瓶（0.6ml）1瓶（0.3ml）按說明書進行稀稀

空白對照1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）即用型

標準品稀釋緩沖液1瓶（5ml）1瓶（2.5ml）即用型

生物素標記的抗IL-6抗體1瓶（6ml）1瓶（3.0ml）即用型

親和鏈酶素-HRP1瓶（10ml）1瓶（5.0ml）即用型

洗滌緩沖液1瓶（20ml）1瓶（10ml）按說明書進行稀釋

底物A1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型

底物B1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型

終止液1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型

 

自備材料

1．蒸餾水。

2．加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。

3．振蕩器及磁力攪拌器等。

 

安全性

1．避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。

2．實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

3．不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

 

操作注意事項

1．試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。

2．實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。

3．不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。

4．使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

5．使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

6．洗滌酶標板時應充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。

7．底物A應揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。

8．加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。

9．按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

 

樣品收集、處理及保存方法

1、血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2、血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。

3、細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4、保存------如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

 

試劑的準備

1．標準品：標準品的系列稀釋應在實驗時準備，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行：

800 pg/ml（6號標準品）原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。

400 pg/ml（5號標準品）100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液

200 pg/ml（4號標準品）100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液

100 pg/ml（3號標準品）100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液

50 pg/ml（2號標準品）100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液

25 pg/ml（1號標準品）100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液

0 pg/ml（空白對照）原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

 

2．洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

 

操作步驟

1．使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產生加樣上的誤差。

2．根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用復孔的盡量做復孔。

3．加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。

4．甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。

5．每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。

6．甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。

7．每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。

8．取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結果。

9．在450nm波長處測定各孔的OD值。

 

建議使用的實驗方案

標準品濃度（pg/ml）

A800800樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品

B400400樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品

C200200樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品

D100100樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品

E5050樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品

F2525樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品

G00樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品

H樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品

 

 

局限

6號標準品以上的結果為非線性的，根據此標準曲線無法得到的結果。

 

試劑盒性能

1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。

2. 特異性：不與其它細胞因子反應。

3. 重復性：板內、板間變異系數均小于10%。

 

結 果 判 斷 與 分 析

1、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

 

2、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應的IL-6標準品濃度為橫坐標（X），做得相應的曲線，樣品的IL-6含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。

 

3、檢測值范圍：0-800pg/ml

 

4、敏感度： 1.0 pg/ml