血清蛋白醋酸纖維原理及操作

原理
膠體顆粒在一定條件下可以帶有電荷，帶有電荷的膠體顆粒又可以借靜電吸引力在電場(chǎng)中泳行，帶正電荷者泳向負(fù)極，帶負(fù)電荷者泳向正極，此種現(xiàn)象稱(chēng)為電泳。
血清中各種蛋白質(zhì)都有它*的等電點(diǎn)。各種蛋白質(zhì)在各自的等電點(diǎn)時(shí)呈電中性狀態(tài)，它的分子所帶正電荷量與所帶負(fù)電荷量相等。將蛋白質(zhì)置于比其等電點(diǎn)較高的PH緩沖液中，它們將形成帶負(fù)電荷質(zhì)點(diǎn)，在電場(chǎng)中均向正極泳動(dòng)。由于血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，帶電荷量多少有差異，蛋白質(zhì)的分子量大小也不同，所以在同一電場(chǎng)中泳動(dòng)速度也不同。蛋白質(zhì)分子小帶電荷多，泳動(dòng)速度快；分子大而帶電荷少，泳動(dòng)較慢。血清蛋白在PH8.6的巴比妥緩沖液中進(jìn)行電泳，按其泳動(dòng)速度可以分出以下的主要區(qū)帶，從正起依次為白蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白等區(qū)帶。
操作
1． 醋纖膜剪成2×8㎝大小，用鉛筆在一端標(biāo)號(hào)；
2． 電泳液：巴比妥-巴比妥鈉緩沖液（稱(chēng)取巴比妥2.21克，巴比妥鈉12.36克，溶于1000ml水中）；
3． 醋纖膜浸于電泳液中20min左右，夾于潔凈濾紙中，吸去多余的緩沖液；
4． 將醋纖膜毛面向上貼于電泳槽支架上拉直，用邊緣整齊的玻片沾取少量無(wú)溶血血清，按壓于醋纖膜標(biāo)號(hào)一端約2㎝處，注意與膜的邊緣保持一定距離，待血清滲入膜后，濾紙上吸去多余血清；
5． 反轉(zhuǎn)醋纖膜，使光面朝上貼于電泳槽中紗布兩端，使其自然充滿(mǎn)緩沖液，稍待片刻；
6． 接通電源，注意正負(fù)極切勿接錯(cuò)，電壓90～150V，電流0.4～0.6mA/㎝，通電45分鐘（冬季時(shí)間稍長(zhǎng)60min）；
7． 關(guān)閉電源，取出醋纖膜染色；
8． 染色：氨基黑10b染色液（稱(chēng)取氨基黑10B0.1克，溶于無(wú)水乙醇20ml中，加冰醋酸5ml溶解；另取磺基水楊酸2.5克，溶于74.5ml水中；將二者混合搖勻即可）染色8min；
9． 漂洗：漂洗液（甲醇45ml、冰醋酸5ml與水50ml混勻）中漂去多余的染料，直至背景無(wú)色為止；
10． 洗脫，將漂洗干凈的醋纖膜吸干，剪下各染色的蛋白區(qū)帶放入相應(yīng)的試管中，同時(shí)剪下與白蛋白寬度相當(dāng)?shù)目瞻讌^(qū)帶作空白對(duì)照，在白蛋白管內(nèi)加0.4mol/L氫氧化鈉6ml（吸光度值×2），其余各管中加入3ml，振搖數(shù)次，置于37℃水溫箱中20min，使其染料浸出；
11． 比色：620nm處讀取各管吸光度值，然后計(jì)算出各自的含量；
12． 計(jì)算：吸光度值相加得總和，然后計(jì)算各自的吸光度值所占總吸光度值的百分比即為各自蛋白質(zhì)的百分含量；