由于 ELISA（酶聯(lián)免疫試驗(yàn)）具有靈敏度較高、特異性好的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于各種傳染性疾病的篩查如肝炎、愛(ài)滋、優(yōu)生優(yōu)育等。雖然洗板只是ELISA實(shí)驗(yàn)重要環(huán)節(jié)中的一個(gè)，但作為專(zhuān)業(yè)的洗板機(jī)生產(chǎn)廠家，我們必須對(duì)影響ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果各因素有一定的認(rèn)識(shí)。的 試劑 ，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。如不注意，就易出現(xiàn)白板、花板、色弱和假陽(yáng)性等現(xiàn)象。尤其是花板現(xiàn)象（就是空白、陰性、陽(yáng)性對(duì)照以及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常，而標(biāo)本孔的OD值卻明顯偏高）是各個(gè)廠家洗板機(jī)調(diào)試中經(jīng)常遇到的問(wèn)題。現(xiàn)將ELISA實(shí)驗(yàn)操作中注意事項(xiàng)總結(jié)如下，以期給大家?guī)?lái)一些啟發(fā)，以改善洗板機(jī)的安裝調(diào)試水平，提高臨床檢測(cè)質(zhì)量。
1 標(biāo)本及采集、貯運(yùn)因素
嚴(yán)重溶血 ，以 HRP 為標(biāo)記的ELISA 測(cè)定中，殘留在孔內(nèi)的血紅蛋白具有過(guò)氧化物酶樣活性，催化底物顯色造成假陽(yáng)性； 混有紅細(xì)胞的血清 易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈；如有 細(xì)菌污染 ，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)； 標(biāo)本凝固不全 ，有時(shí)為了爭(zhēng)取時(shí)間快速檢測(cè)，常在血液還未開(kāi)始凝固時(shí)即強(qiáng)行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測(cè)定過(guò)程中可以形成肉眼可見(jiàn)的纖維蛋白塊，易造成假陽(yáng)性結(jié)果； 采血試管洗滌不* 、反復(fù)使用易交叉污染； 塑料試管能吸附抗原物質(zhì) ，樣本久置在塑料管內(nèi)會(huì)使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性。
血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)，嚴(yán)重溶血標(biāo)本禁用。一般說(shuō)來(lái)，在 5 天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于4℃，標(biāo)本在冰箱中保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致血清IgG 聚合，使間接法的 試劑 本底加深。超過(guò)一周測(cè)定的需－20℃保存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡。混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過(guò)濾，澄清后再檢測(cè)。反復(fù)凍融會(huì)使 抗體 效價(jià)跌落，所以測(cè) 抗體 的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測(cè)，宜少量分裝冰存；使用一次性玻璃試管或真空管采血管；并使用非抗凝標(biāo)本，肝素抗凝血漿會(huì)增加OD值，可能與高濃度肝素具有強(qiáng)大的負(fù)電荷能吸附酶標(biāo)記物不易洗脫有關(guān)；EDTA、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過(guò)氧化物酶活性；血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標(biāo)本采集時(shí)用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽?br />2、試劑的影響
ELISA試劑盒診斷試劑經(jīng)歷了從合成肽向基因工程抗原的過(guò)渡。由于歷史的原因，人們往往以反應(yīng)本底的好壞來(lái)衡量ELISA 反應(yīng) 試劑 盒，因此有些廠家為了保持較好的本底采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被，該類(lèi) 試劑 盒的流行病學(xué)敏感度不夠，穩(wěn)定性也成問(wèn)題。也有廠家堅(jiān)持 試劑 盒高的流行病學(xué)敏感度，科學(xué)地對(duì)待反應(yīng)結(jié)果。基因工程抗原較合成肽抗原有*的*性，就HCV-ELISA 試劑 盒來(lái)講，*代產(chǎn)品為合成肽抗原，主要是HCV 特異性抗原決定簇的肽片段；第二代產(chǎn)品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是當(dāng)時(shí)的基因工程抗原不全，僅包括了HCV 的核心區(qū)片段；第三代產(chǎn)品基本上采用了基因工程抗原，而且這些抗原包括更多、更穩(wěn)定、純度更高的HCV 特異性抗原。第三代 試劑 的敏感度大大提高了。基因工程抗原與合成肽抗原的區(qū)別如下：
基因工程抗原是抗原基因在質(zhì)粒載體中原核或真核表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或 酵母 菌為表達(dá)系統(tǒng)。該類(lèi)抗原與合成肽相比具有以下特點(diǎn)：
a.分子量大。合成肽采用化學(xué)方法制備，由于工藝的局限，合成數(shù)量有限，只能達(dá)到數(shù)百個(gè)氨基酸；而利用基因工程制備的抗原，分子量更大。
b.穩(wěn)定性好。包被的抗原的穩(wěn)定性可使 試劑 盒的效期得到保證，早期以合成肽為包被抗原的 試劑 盒效期只有3-4 個(gè)月，采用基因工程抗原后效期大大延長(zhǎng)了。
c.基因工程抗原將特異性抗原決定簇基因融合表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物包含更多的抗原決定簇，可提高 試劑 盒的靈敏度，提高檢出率。
d.純化難度大。基因工程抗原的純化技術(shù)難度較大。
合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特點(diǎn)： a.分子量太小；b.一般只含有一個(gè)抗原決定簇；c.純度高；d.穩(wěn)定性差。
國(guó)內(nèi)乙肝兩對(duì)半試劑廠家較多；不同廠家出產(chǎn)的試劑靈敏度與特異性存在一定的差別，資料顯示，不同廠家試劑的特異性和敏感性分別為 89.4%—99.3%,78%—89%存在較大差異。有的廠家酶標(biāo)板孔間A值差大于15%；標(biāo)記酶的活性及顯色液的穩(wěn)定比較差。使用質(zhì)劣的試劑必然導(dǎo)致結(jié)果的假陽(yáng)性或假陰性。因此。選擇高質(zhì)量的試劑是保證結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵之一。
• 選擇試劑時(shí)應(yīng)選擇靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性好、批間差小、操作方便省時(shí)的優(yōu)良檢測(cè)試劑，國(guó)家參比實(shí)驗(yàn)室每年對(duì)各廠家的試劑進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估并定期公布評(píng)估結(jié)果，可作為選擇試劑的主要依據(jù)。
• 要注意試劑的批號(hào)和出廠日期，雖然試劑的有效期多為 1年。選擇剛出廠的試劑使用。
不同廠家的試劑不能混用。
不同方法學(xué)的檢測(cè)試劑，會(huì)使兩對(duì)半結(jié)果出現(xiàn)一些不同。例如：在實(shí)際工作中常用 ELISA檢測(cè)HBsAg結(jié)果為陰性，而電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)為陽(yáng)性。除方法學(xué)的靈敏度外；還存在使用單抗或多克隆抗體試劑的差別。單抗對(duì)變異抗原或亞型乙肝標(biāo)志物檢測(cè)存在差異，建議試劑廠家對(duì)劑的制備應(yīng)該考慮亞型及型濃度的問(wèn)題。
3、操作技術(shù)的影響
操作過(guò)程的控制：
⑴ 嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。操作前將試劑在室溫下平衡30～60min。
⑵ 加樣后及時(shí)放人孵箱。標(biāo)本較多時(shí)，要分批操作。按說(shuō)明步驟嚴(yán)格控制操作時(shí)間，防止孵育時(shí)間人為延長(zhǎng)，導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周?chē)y以清洗*。
（3）封板溫育時(shí)，各孔一定要封嚴(yán)，防止陽(yáng)性標(biāo)本的液體蒸發(fā)，產(chǎn)生周邊現(xiàn)象從而導(dǎo)致“花板”的出現(xiàn)。
（4）用洗板機(jī)洗板時(shí)，保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板后在吸水紙（選擇干凈、無(wú)或少塵的吸水材料）上輕輕拍干：還要防止針口有纖維蛋白或異物，這些異物在洗板的過(guò)程中易產(chǎn)生拖帶現(xiàn)象而導(dǎo)致“花板”的出現(xiàn)。
（5）合理安排檢測(cè)量，以免反應(yīng)板過(guò)多造成洗板等待時(shí)間長(zhǎng)。
（6）加酶試劑后用吸水紙?jiān)诿笜?biāo)板表面輕拭吸干。
（7）顯色劑盡量在臨用前配制，堅(jiān)持不用過(guò)期顯色劑，肉眼可見(jiàn)淺藍(lán)色的TMB顯色劑不用。
（8）加樣時(shí)保持顯色劑不外流；A、B液應(yīng)避免接觸金屬器械。加終止液時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。
（9）應(yīng)保證酶標(biāo)板清潔，整個(gè)操作過(guò)程中保證酶標(biāo)板不接觸次氯酸。以上的措施可以使“花板”降至zui低限度。從而提高檢測(cè)的特異性。并得到更準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
加樣吸嘴的潔凈與否和吸量的準(zhǔn)確性，直接影響檢測(cè)結(jié)果。由于吸嘴構(gòu)造特殊，導(dǎo)致清洗困難，加大了交叉污染的機(jī)會(huì)。建議用一次性吸嘴。加樣器也要經(jīng)常清洗，定期校準(zhǔn)。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在 ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出。
溫浴影響，在建立ELISA試劑盒方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明，兩次抗原 抗體 反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2 小時(shí)，產(chǎn)物的生成可達(dá)。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。由于公司的 試劑 盒溫育是在空氣浴中完成，采用水浴會(huì)造成值偏高或花板。另外溫育中還有邊緣效應(yīng)，邊上的值會(huì)偏高，建議為了客觀的判斷結(jié)果，將質(zhì)控放在非邊緣位置。96孔酶標(biāo)板結(jié)構(gòu)特別；易產(chǎn)生邊緣效應(yīng)，抗原抗體結(jié)合及酶促反應(yīng)對(duì)溫度有嚴(yán)格要求，酶標(biāo)板周?chē)c內(nèi)部孔升降溫速率不同，造成周邊與內(nèi)部孔結(jié)果差異；干浴與水浴存在明顯的差異，盡可能使用水浴，并要求固相板放入水中，減少受熱不均，貼密封膜，防止污物浸入。
總之，的ELISA試劑盒，良好狀態(tài)的儀器，排除各種影響因素的干擾和正確的操作是保證ELISA 檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。